Introducción: La hipoacusia es una de las discapacidades más frecuentes en los países industrializados. Más del 5% de la población mundial, presenta una pérdida auditiva discapacitante. En los mamíferos la hipoacusia neurosensorial es irreversible y el motivo fundamental es que las células ciliadas de la cóclea adulta carecen de capacidad regenerativa. Los recientes avances en biología del desarrollo, genética y biología celular del oído interno han llevado la investigación en esta patología a nuevas aproximaciones terapéuticas, que incluyen medicina regenerativa y células madre. El objetivo general de este trabajo de tesis es obtener in vitro células "tipo" ciliadas de oído interno a partir de la diferenciación de células madre mesenquimales humanas provenientes de tejido adiposo.

Materiales y métodos: Se aisló y cultivó la fracción estromal vascular obtenida de tejido adiposo humano. Se caracterizaron las células madre de tejido adiposo humano (hASC) mediante inmunocitoquímica y citometría de flujo. Las hASC se diferenciaron a linaje ótico, aplicando un protocolo de reprogramación química de dos pasos por un total de 48 días. Las células diferenciadas se fijaron y se extrajo el ARN a los días 10 y 48 para analizar la expresión de los marcadores de células progenitoras óticas, neuronales y de células ciliadas del oído interno. Asimismo, se llevó a cabo un novedoso protocolo de activación de genes endógenos mediante el sistema CRISPR-dCas9-VP160. Para ello se diseñaron cuatro ARN guías para activar los genes blancos, SOX2, ATOH1, POU4F3 y GFI1. Los ARN guías y los plásmidos dCas9-VP160 se lipofectaron en células HEK293T y hASCs. Los resultados fueron analizados por RT-qPCR al día 4 post-lipofección.

Resultados: Al día 10 de la diferenciación química, se detectó la expresión de marcadores de placoda ótica: PAX2 (90,9 ± 0,16%), PAX8 (44,2 ± 0,03%) y BMP7 (86,4 ± 0,24%). También fueron detectados marcadores de células ciliadas del oído interno y progenitores neurales: POU4F3 (24,2 ± 0,05%), MYOVIIa (10,8 ± 0,05%) y BIII TUBULINA (28,8 ± 0,37%). Al día 48, se observó un aumento de los marcadores de células ciliadas del oído interno (33,2 ± 0,04% MYOVIIa, 33,9 ± 0,3% POU4F3 y 14,3% ATOH1), una disminución de los marcadores progenitores óticos (46,2 % PAX2 y 15,9% PAX8) y ausencia de marcadores neurales. Otros dos marcadores de progenitores óticos (p27kip1 y EYA1) se regularon positivamente después del primer paso de diferenciación. Por último, el sistema CRISPR-VP160 activo significativamente a los genes SOX2, ATOH1 y POU4F3 (p<0.05) en las células HEK293, y al gen ATOH1 en las hASCs (p<0.05).

Conclusión: Los resultados obtenidos nos permiten concluir que es posible obtener in vitro células "tipo" ciliadas de oído interno a partir de la diferenciación de hASCs, aportando información de referencia para el desarrollo de nuevas terapias de reemplazo celular en hipoacúsicos.

Palabras clave del autor: Hipoacusia; Células Ciliadas; Oído Interno; Células Madre; Reprogramación Celular; CRISPR - CRISPR/dCas9